小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

海馬體主要負(fù)責(zé)記憶和學(xué)習(xí)，日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中。神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元具有長突起，由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。

       小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的組織來源于實(shí)驗(yàn)小鼠的正常腦組織，因?yàn)楹ｑR神經(jīng)元細(xì)胞類似于干細(xì)胞屬于高分度分化的細(xì)胞特性，具有不能傳代，不能增殖等特點(diǎn)，所有收到細(xì)胞后盡快使用。

       1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑

       （1）儀器

        生物安全柜

        CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱

        熒光倒置顯微鏡

        高速冷凍離心機(jī)

        電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱

       （2）試劑耗材

         T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

         血球計數(shù)板

         細(xì)胞培養(yǎng)孔板

         紅細(xì)胞裂解液

         神經(jīng)元*培養(yǎng)基

         0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

         多聚甲醛（PFA）

         DAPI

         Triton X-100

         山羊血清

         NSE

         Goat anti-Rabbit lgG（H+L）

         Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594

         Fluoromount-G熒光封片劑

       2.分離培養(yǎng)方法

         1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，

         2) 在冰浴的PBS中分離海馬，PBS洗滌3次，剪碎，

         3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化30min，

         4) 用FBS終止消化，輕輕吹打，

         5) 過100 μm 濾網(wǎng)，

         6) 收集濾液，300 g離心5 min，

         7) 用*培養(yǎng)基重懸沉淀，鋪瓶。

        3.免疫熒光

        3.1.實(shí)驗(yàn)步驟 

      （1）細(xì)胞爬片

        取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細(xì)胞0.02million個/孔。置培養(yǎng)箱2h或過夜。

      （2）固定

        細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃過夜。

      （3）破膜封閉

        將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，

        玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，

        取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。

      （4）一抗孵育

        一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋

        破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（多可放置一周）

      （5）二抗孵育

       室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

     （6）包埋

       玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。

       鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞

       3.2.檢測結(jié)果 

     （1）細(xì)胞免疫熒光鑒定照片

       陰性

                           100X-DAPI                                             100X-Fluorescence

       NSE

                             100X-DAPI                                          100X-Fluorescence

       （2）檢驗(yàn)基本情況：

        經(jīng)免疫熒光鑒定，該細(xì)胞純度達(dá)到90%以上。